母乳是嬰兒成長(cháng)過(guò)程中重要的食品，國內外的孕嬰保健機構都建議初生嬰兒采用母乳喂養。母乳中含有的營(yíng)養成分，如蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)等，易于嬰兒吸收。另外其所含有的抗感染因子，如IgA、乳鐵蛋白、溶菌酶及各種細胞成分，可增強嬰兒的免疫能力。因此，母乳中營(yíng)養成分研究也成為營(yíng)養學(xué)的一大領(lǐng)域。目前，已有對母乳中的維生素進(jìn)行研究并加以報道，但少有氨基酸的研究報道。本研究采用酸性條件下水解母乳中蛋白質(zhì)，柱前在線(xiàn)衍生與液相色譜紫外聯(lián)用分析母乳中氨基酸。

樣品前處理

17種氨基酸混標溶液（除胱氨酸濃度為1.25μmol/ml，其它氨基酸濃度為2.5μmol/ml）

7M鹽酸：量取558ml鹽酸，用水稀釋至1000ml量瓶中，搖勻。

樣品由第三方醫療機構收集不同哺乳期婦女的乳液樣品。樣品呈乳白色懸濁液（含有少量黃色液體油脂。低溫保存時(shí)，樣品取出后放置在40°C水浴中使固體油脂融化）。

水解：吸取1ml脫脂后的母乳樣品轉移至真空水解管中，加入0.6ml水解催化劑，在0.05MPa壓力下充氮保護3分鐘，再減壓脫氣3分鐘，密塞水解管并置于沸水浴上恒溫加熱8小時(shí)，冷卻至室溫，用40%氫氧化鈉溶液調節pH值2-3范圍內，用0.1N鹽酸溶液稀釋并定容至10ml，搖勻并用微孔（0.22μm）濾膜過(guò)濾用于液相分析。

衍生程序

采用鄰苯二甲醛和氯甲酸芴甲酯在堿性條件下分別與一級氨基酸和二級氨基酸發(fā)生反應，生成具有強烈紫外吸收的化合物。衍生過(guò)程在自動(dòng)進(jìn)樣器中進(jìn)行。

衍生試劑：

硼酸緩沖液： 200mM 四硼酸鈉溶液（pH=10.2）

鄰苯二甲醛溶液（OPA）：50mg/ml(甲醇)

OPA/MPA溶液：0.8ml 硼酸緩沖液-0.2ml OPA溶液-20μl 3-巰基丙酸

氯甲酸芴甲酯（FMOC）溶液：2.5mg/ml（乙腈）

稀釋液：流動(dòng)相A

衍生過(guò)程：200mM 硼酸緩沖液（5μL）+樣品（1μL）+OPA/MPA溶液（1μL）+FMOC溶液（1μL）+稀釋液（8μL）

儀器型號：

UltiMate3000:

LPG-3400，SN:8014896

WPS-3000TSL, SN:8014671

TCC-3000, SN:801179

DAD， SN:8037084

變色龍®色譜管理軟件（Chromeloeon®6.8 SR11）

色譜條件：

色譜柱 ： Hypersil GOLD C18色譜柱, 4.6×250mm, 5μm, PN:25005-254630

流動(dòng)相 ：A: 20mM 乙酸鈉（加0.018%三乙胺，調節pH值至7.2，再加入0.3%四氫呋喃），B：100mM乙酸鈉（pH=7.2）-乙腈-甲醇（20:40:40）

梯度洗脫程序

進(jìn)樣量： 1μL

檢測器：檢測波長(cháng)：380nm, 262nm, 3D掃描：190-400nm，采集頻率：5Hz

流速： 1000μL/min

柱溫：  35°C

實(shí)驗數據

01

水解條件優(yōu)化

在水解過(guò)程中，加熱溫度、水解持續時(shí)間和催化劑用量對水解有著(zhù)重大影響。結合實(shí)際情況采用沸水浴加熱進(jìn)行水解，因此利用響應面法對水解時(shí)間和催化劑用量的影響進(jìn)行了研究，結果見(jiàn)表1和圖1。

表1 水解研究方案

圖1 氨基酸水解優(yōu)化結果

從圖1中可以看出，水解時(shí)間延長(cháng)對氨基酸增加效果不明顯，水解催化劑用量對水解效率有顯著(zhù)影響，隨著(zhù)用量增大，氨基酸含量明顯增加，且達到大值，再增加用量時(shí)，氨基酸含量開(kāi)始降低，可能原因是水解后的氨基酸在強酸性環(huán)境與高溫加熱條件下中發(fā)生降解從而引起含量降低。綜合實(shí)際操作考慮，故用0.6ml水解催化劑在沸水浴中水解8小時(shí)可獲得佳水解氨基酸含量。

02

 方法專(zhuān)屬性

取0.1N鹽酸做為空白試劑考察方法專(zhuān)屬性，結果見(jiàn)圖2和3。

03

線(xiàn)性范圍

取氨基酸混標溶液用1%鹽酸（約0.1N）稀釋成濃度為0.025、0.05、0.125、0.25、0.50μmol/ml的溶液，按照前述條件測定其響應值，并與濃度做線(xiàn)性回歸，結果見(jiàn)表4。

04

方法精密度

取對照品溶液，連續進(jìn)樣5針，結果見(jiàn)圖4。

05

方法度

按前述方法平行測定母乳樣品與加標樣品，計算其含量與加標回收率。結果見(jiàn)圖5與表5。

表5加標回收率（樣品編號：12-8，n=2）

結論

通過(guò)上述方法學(xué)考察結果分析，本方法具有線(xiàn)性范圍寬、專(zhuān)屬性強、結果準確，可用于母乳中測定氨基酸含量。