我們在實(shí)驗過(guò)程中經(jīng)常遇到這樣的問(wèn)題：

實(shí)驗室新買(mǎi)了UHPLC,想要將原來(lái)的HPLC方法轉移到新的機器上,卻不知道該怎么著(zhù)手？

在文獻中查找到一個(gè)UHPLC建立的快速分析方法，如何將這個(gè)方法轉移到僅有HPLC的實(shí)驗室呢？

今天來(lái)為大家講一講，HPLC和UHPLC之間的方法轉換時(shí)應該注意哪些問(wèn)題？怎樣來(lái)選擇合適的色譜柱？

主要內容

1. 方法轉換中的不可變條件

2. 方法轉換中的變化條件 

3. 方法轉換中的基本調整規則

1. 方法轉換中的不可變條件

在方法轉換的時(shí)候，為了達到良好的分離情況，我們應該盡可能保持與HPLC分析方法中的主要分離條件一致。

(1) 在色譜柱中使用填料的性質(zhì)和選擇性應當相同。

(2) 使用的流動(dòng)相組成（強洗脫有機溶劑、緩沖物組成、pH等）應該相同。

(3) 檢測器的工作條件（檢測波長(cháng)）應該相同。

(4) 柱溫應當相同。

2. 方法轉換中的變化條件

方法轉換的過(guò)程中，通常是通過(guò)更換與UHPLC系統相匹配的，具有相同分離性能的色譜柱規格，調整流速來(lái)提高分離效率。

以下幾點(diǎn)是我們需要特別注意的地方。

(1) 填料的粒徑由大變小。

(2) 色譜柱的內徑由寬變窄。

(3) 色譜柱的長(cháng)度由長(cháng)變短。

(4) 色譜柱的壓力降由低變高。

(5) 色譜儀系統的死體積和梯度滯留體積由大變小。

(6) 流動(dòng)相的流速由大變小。

(7) 洗脫時(shí)間由長(cháng)變短。

3. 方法轉換中的基本調整規則

現在，大家已經(jīng)了解 HPLC→UHPLC 方法轉換時(shí)應該注意的可變條件和不可變條件了，那么具體怎么操作呢？

下面讓我們通過(guò)一個(gè)例子來(lái)掌握這項實(shí)用的工作技能吧。

例如，一個(gè)HPLC分析方法，使用色譜柱的規格是 4.6mm×250mm×5um；流速為1mL/min,柱壓為10Mpa,進(jìn)樣體積為10uL.

那么，如果換成粒徑為2um的UHPLC柱，柱長(cháng)、流速、壓力、進(jìn)樣量該如何來(lái)選擇呢？

我們可以按照下面的步驟逐步來(lái)計算：

調整步驟

柱長(cháng)、粒徑的選擇

流速的調整

色譜柱的壓力

進(jìn)樣量的調整

（1）色譜柱規格的調整

首先引入一個(gè)分離效能的概念：

Se=L/dp

式中，L為色譜柱的柱長(cháng),mm;dp為色譜柱粒徑,um。

對于不同的色譜柱，只要能保持柱長(cháng)和粒徑的比值相同，那么分離效果就是差不多的。

柱長(cháng)的計算：

L2=L1×(dp2/dp1)

L2=250×(2/5)mm=100mm

根據以上計算結果，我們就可以選擇規格為2.1mm×100mm×2um的CAPCELL PAK IF2 色譜柱了。

（2）流速的調整

我們還是利用上面這個(gè)例子，現在規格選好了，那么流速設置多少更合適呢？

流速的計算：

式中，F為流速，dc為色譜柱內徑，dp為填料的粒徑。

F2=1×(2.1/4.6)×(2.1/4.6)×(5/2)mL/min=0.52mL/min

根據以上計算結果，我們可以將流速設置為0.52mL/min.

（3）色譜柱的壓力

柱壓的計算一般使用下面的公式：

按上述計算方法，確定色譜柱規格和流速以后，在估算色譜柱的壓力時(shí)，可以僅考慮填料粒徑的影響，近似式為

式中，p為柱壓。

p2=10×(5/2)×(5/2)Mpa=62.5Mpa

CAPCELL PAK  IF2 具有超高的耐壓性能，耐壓可達100Mpa，*符合替換要求。

（4）進(jìn)樣量的調整

對進(jìn)樣量的計算：

式中：Vinj 為進(jìn)樣量。

V2=10×(2.1/4.6)×(2.1/4.6)×(100/250)=0.83uL

在這里留個(gè)思考題：

色譜柱規格變化之后，為什么要調整進(jìn)樣量呢？

您可以根據自己試驗的實(shí)際情況或檢測限的要求來(lái)調整進(jìn)樣量。

這個(gè)開(kāi)始看似很復雜的方法轉換問(wèn)題，經(jīng)過(guò)我們一步一步地計算，是不是變得很簡(jiǎn)單了呢？

HPLC→UHPLC的轉換結果

如果您現在正好有HPLC的項目，可以自己嘗試轉化成UHPLC方法，不僅可以提高分離效率，還能省下不少試劑呢！